實(shí)驗(yàn)操作因素對(duì)ELISA結(jié)果的影響
ELISA測(cè)定一般遵循以下步驟:固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
目前各種形式的ELISA自動(dòng)分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng),如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動(dòng)酶免分析儀,其試劑為開放式的,而對(duì)于其它類型的,則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用手工操作加儀器測(cè)定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜,操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具,其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或者推動(dòng)桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn),尤其是對(duì)于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室,因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時(shí)均需更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快,避免將標(biāo)本加在孔壁上部,并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響,操作時(shí)差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時(shí)間的差異。遠(yuǎn)慕生物供應(yīng)： 操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都存在,尤其是手工操作,日常檢測(cè)標(biāo)本多達(dá)幾百個(gè),從加入*個(gè)標(biāo)本到zui后一個(gè)標(biāo)本,需幾十分鐘,加入試劑及混勻等均存在著前后時(shí)間差異,使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致,操作時(shí)差對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的結(jié)果影響更大,在加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道。
正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對(duì)數(shù)紙，以檢測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是的檢測(cè)區(qū)域。
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