肺泡上皮細胞(AECs)是肺細胞的主要類型之一，可用于分析肺上皮細胞對外界因素的反應。因此，小鼠肺部的AECs可以作為疾病的體外模型。AECs對于研究肺的發(fā)育、損傷和修復是*的。從事呼吸系統(tǒng)疾病如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、囊性纖維化、肺氣腫和肺炎研究的人員通常依賴AECs進行研究。
一、AECs需要特殊處理
第1次分離小鼠肺泡上皮細胞是很棘手的，肺上皮細胞周圍有大量的白細胞和內皮細胞需要分離。更復雜的是，AECs需要通過分散酶消化而從肺的細胞外基質中釋放出來。分散酶能特異性地裂解存在于AECs基底膜中的IV型膠原蛋白和纖連蛋白，需要通過氣管艱難地注入。
二、區(qū)分肺泡上皮細胞的類型
肺泡上皮細胞有兩種類型：I型肺泡上皮細胞(AECI)和II型肺泡上皮細胞(AECII)。
AECI很薄，是一種細長的鱗狀細胞，主要幫助肺泡和血液之間的氣體交換。AECII是一種小立方形的細胞，分泌肺表面活性物質以降低肺泡表面張力。由于AECII更豐富(大約占ACEs的60%)，它們比AECI更容易分離。因此，大多數人從肺中分離出初生AECII細胞，然后對它們進行分化，以獲得AECI樣表型。
三、從小鼠肺中分離AECII細胞
分離肺泡上皮細胞著名和廣泛遵循的protocol是由M. Corti和他的同事描述的, 為了達到高純度，不同的小組對原始協(xié)議進行了修改。如下分享一些小技巧，將幫助優(yōu)化您的細胞分離方法，以獲得那些>90%的純細胞。
優(yōu)化消化步驟
在肺提取步驟，優(yōu)化肺組織在分散酶的孵育條件，因為它是肺組織成功消化的關鍵步驟，影響產量。經過嘗試，終優(yōu)化得到適條件，37℃孵育20 min，在2ml分散酶中連續(xù)旋轉。
優(yōu)化上皮細胞的分離
肺組織消化后，獲得單細胞懸液。為了從所需的上皮細胞中分離血細胞，使用Corti等人推薦的CD45和CD16/32抗體濃度。但Corti研究中提到的磁珠分離系統(tǒng)比較舊，嘗試使用Promega公司的鏈霉親和素包被的磁珠和相應的分離柱。這種磁珠分離裝置也可用于純化其他類型的細胞(如污染白細胞中的內皮細胞)。
優(yōu)化上皮細胞的純化
根據Corti 的protocol, 磁性柱中CD45和CD16/32陰性群體(上皮細胞)可進一步純化，在培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)4h -16h。很明顯，這種長時間的孵化需要優(yōu)化。
細胞培養(yǎng)分別采用4h、8h和16h，并監(jiān)測它們的純度。有趣的是，4小時后已經用流式細胞儀觀察到了>90%的純度。雖然較長的培養(yǎng)時間導致相同的純度，但由于上皮細胞附著在培養(yǎng)皿上，導致產量下降。
細胞純度的后檢查
4小時后，細胞可以從培養(yǎng)皿的上清液中收集。使用Corti等人的協(xié)議，以及概述的優(yōu)化步驟，獲得的AECII細胞應該是高純度的(大約90%)，使用流式細胞術通過上皮細胞粘附分子(EpCAM)染色可進行檢測。然后，它們可在氣道上皮培養(yǎng)基中37℃下5% CO2進行培養(yǎng)。使用這種特殊培養(yǎng)基的優(yōu)點是它支持生長而不需要添加FBS。含有FBS的培養(yǎng)基可以引起細胞的自發(fā)激活，在實驗室中是需要避免的。
這些高純度的AECII細胞可以直接用于實驗，也可以進行分化，分化為AECI，通過在5% CO2、37℃，在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)7天。
