一、總RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。
1. 提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 ╳106個細胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；
2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；
4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；
5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；
6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
二、瓊脂糖核酸電泳
1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；
2. 根據(jù)欲分離DNA 片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；
4. 室溫下30~45分鐘后凝膠*凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；
5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；
6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；
7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；
8. 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；
9. 電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。
瓊脂糖凝膠濃度 線形DNA的最佳分辨范圍（bp）
0.5% 1,000～30,000
0.7% 800～12,000
1.0% 500～10,000
1.2% 400～7,000
1.5% 200～3,000
2.0% 50～2,000
三、膠回收純化DNA
1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；
2. 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，45℃～55℃溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；
3. 取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；
4. 加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；
5. 重復(fù)操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；
6. 將純化柱放入一個新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步驟不變。
 |
 |
 |
