1、蛋白胨稀釋液的制備:
將1g蛋白胨(細(xì)菌蛋白胨除外)溶于1000mL去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌溫度為121℃。時長15分鐘。
2、微量元素溶液制備:
微量元素水溶液營養(yǎng)成分的組成如表1所示
微量元素 | 濃度 |
氯化鈉 | 10mg/mL |
七水硫酸/亞鐵 | 18mg/mL |
一水硫酸錳 | 16mg/mL |
七水硫酸鋅 | 1.6mg/mL |
五水硫酸銅 | 1.6mg/mL |
七水硫酸鈷 | 1.6mg/mL |
3、液化GYE瓊脂培養(yǎng)基的制備:
營養(yǎng)成分的組成如表2所示
試劑 | 數(shù)量 |
酵母提取物粉末 | 5.0g |
蛋白胨 | 5.0g |
葡萄糖 | 5.0g |
磷酸/氫二鉀(K2HP04) | 0. 5g |
磷酸二氫鉀(KH2P04) | 0. 5g |
硫/酸鎂 | 0.3g |
微量元素 | 1.0mL |
水 | 1000.0mL |
使用乳酸溶液調(diào)節(jié)上述營養(yǎng)成分混合液pH到6.3。將混合液轉(zhuǎn)移到大錐形瓶中，向錐形瓶中加入15.0g瓊脂。使用鋁箔包裹錐形瓶，將其放置于加熱板上進(jìn)行加熱，并攪摔，直到瓊脂*溶解。隨后在高壓滅菌鍋中在121℃下進(jìn)行至少15分鐘滅菌。待高壓滅菌鍋可以安全打開時，將錐形瓶放置于50℃的水浴中。
4、樣品準(zhǔn)備
4.1 食品取樣
稱取25g樣品，置于無菌均質(zhì)袋中，加225mL滅菌蛋白胨水，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)至*溶解于蛋白胨水，混勻。
注:若樣品不能*溶于蛋白胨水，需要將蛋白胨水預(yù)熱至50℃再加入樣品，或加入樣品后將混合懸浮液置于50℃預(yù)熱5min,直至樣品*溶解。
4.2 檢查混合懸浮液pH值。若pH小于7.0，用氫氧化鈉(5N)溶液調(diào)節(jié)pH至8.5±0.2;若pH大于8.7，用鹽酸溶液(5N)調(diào)節(jié)pH至8.5±0.2。
4.3 樣品移取20-30mL均質(zhì)懸浮液于50ml離心管中于75℃水浴30min,立即冷卻至45℃以下，然后移液。
4.4 移取1.0ml該液于9.0mL滅菌蛋白胨水的試管中，渦旋*混勻(10-2稀釋管即得)。
4.5 根據(jù)要求重復(fù)操作。所做稀釋度及平板培養(yǎng)所用稀釋度應(yīng)隨預(yù)期孢子數(shù)變化而變化。
注1:將每個稀釋度溶液混勻，然后移液;
注2:步驟4.3:將離心管置于水浴后立即開啟計時器。
5、平板培養(yǎng)
5.1 液化GYE瓊脂培養(yǎng)基，然后置于水浴中冷卻至50℃以下(該培養(yǎng)基容易凝固，要置于50℃左右的水浴鍋內(nèi)) ;每個稀釋度準(zhǔn)備兩個無菌培養(yǎng)皿。分別從最后兩個稀釋管溶液中加1.0mL于相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿中，然后將15至20mL的熔融培養(yǎng)基倒至各個培養(yǎng)皿，*混勻。待固化時，將平板翻轉(zhuǎn)，40℃+2℃培養(yǎng)48小時，同時準(zhǔn)備一個只包含瓊脂培養(yǎng)基及一個只含有1.0mL蛋白胨稀釋液和瓊脂培養(yǎng)基作為陰性對照。
6、平板計數(shù)
菌落數(shù)在30至300之間的平板計數(shù)最為理想。平板計數(shù)只記錄滿足以下條件的菌落:瓊脂表面的菌落需要直徑為1mm到5mm;白色到奶色，凸面，具有完整的邊緣和光滑的表面。嵌在瓊脂培養(yǎng)基中的菌落需要直徑為0. 5mm-1mm在瓊脂中具有奶色的點狀體。
6.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi),計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。
6.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式(1)計算:
N= ∑C/ (n1+0.1n2)d........................ (1)
式中:
N-樣品中菌落數(shù):
∑C - 平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和:
n1 - 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù);
n2 - 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù);
d - 稀釋因子(第一稀釋度)。
