細(xì)胞周期分析是分子生物學(xué)常用的實驗方法，尤其在抗腫瘤藥物研究上使用普遍。但細(xì)節(jié)若是處理不好，做得再多也做不出正確的、好看的分布圖。今天遠(yuǎn)慕生物來測下如何準(zhǔn)確制備細(xì)胞周期測試的樣品，科研實驗的小伙伴們一起來了解下！
先簡單介紹下實驗原理
碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，可以與 DNA 和 RNA 結(jié)合，但其不能透過正常的細(xì)胞膜，所以對活細(xì)胞無染色作用。可通過冷乙醇或其他破膜劑的作用，使細(xì)胞膜通透性增加。PI 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，選擇性地與核酸結(jié)合，RNase 裂解 RNA 后，細(xì)胞內(nèi)染料的熒光量與細(xì)胞核內(nèi)的 DNA 含量成正比。通過流式細(xì)胞儀檢測單個細(xì)胞熒光強(qiáng)度得到相對 DNA 含量，根據(jù)各個時相 DNA 含量不同，將細(xì)胞分為不同的周期。
具體操作流程及注意事項
1、將對數(shù)期的細(xì)胞接種于 6 孔板中（2×105 個 / 孔，根據(jù)細(xì)胞大小、增值速度適當(dāng)調(diào)整），每孔加 2 ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2、細(xì)胞貼壁后（根據(jù)細(xì)胞具體情況），去除培養(yǎng)基，分別加入培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 1 ml 孵育（不使用造成細(xì)胞大量死亡的藥物濃度和孵育時間）。
3、藥物作用結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，1500 rpm，離心 4 min。一定要一并收集漂浮的死細(xì)胞，不然會嚴(yán)重影響結(jié)果。
4、消化收取貼壁細(xì)胞，吹打過程一應(yīng)要輕柔充分，避免細(xì)胞受損、細(xì)胞黏連；離心轉(zhuǎn)速為 2000 rpm，離心 4 min（離心轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm，也可以采用 1000 rpm，離心 5 min），PBS 洗 3 遍，以去除培養(yǎng)基、藥物殘留及細(xì)胞碎片。合并培養(yǎng)液和貼壁細(xì)胞。
5、細(xì)胞沉淀中加入少量 PBS，輕柔充分重懸細(xì)胞。然后將重懸的細(xì)胞加入到 4℃預(yù)冷的 70％冰乙醇中固定，輕輕吹打均勻（切記！！！不要將冰乙醇加入到細(xì)胞中，這樣會造成細(xì)胞黏連，嚴(yán)重影響結(jié)果），封口膜封口，4℃過夜。
6、2000 rpm 離心 4 min，吸去固定液，PBS 洗兩次，以去除固定液。
7、細(xì)胞中加入含 PI（50 μg/ml）、RNaseA（50 μg/ml，去除 RNA）和曲拉通（1％，通透細(xì)胞膜）的工作液 200 μl（曲拉通粘性大，配置時一定要渦旋，保證混合均勻），室溫避光孵育 30 min。按照步驟 1 中的鋪板細(xì)胞數(shù)，這個體積的工作液可以保證測試時的細(xì)胞濃度正合適。
8、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。染色后，可以使用 PBS 去除染液，也可選擇不處理，親測沒有影響。
9、FlowJo 軟件分析細(xì)胞周期時相分布。
實驗人注意！注意！！注意！！！
整個過程一定要盡量降低操作對細(xì)胞的損傷，要吹打輕柔，減少離心次數(shù)，轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm。
消化細(xì)胞時要保證細(xì)胞吹散，不要有細(xì)胞黏連，一旦這一步驟沒有消化充分，后面很難再將細(xì)胞吹散，后果嚴(yán)重。
測試時細(xì)胞濃度一定要根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測范圍，不然可能會影響準(zhǔn)確度。
