實(shí)驗(yàn)概要
本實(shí)驗(yàn)介紹了根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備及凍融法轉(zhuǎn)化。
主要試劑
利fu平，LB培養(yǎng)基，NaCl，CaCl2，YEP培養(yǎng)基，ka那霉素
主要設(shè)備
搖床，高速離心機(jī)，低溫冰箱，水浴鍋
實(shí)驗(yàn)材料
根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備
1) 挑取單菌落GV3101，接種于5mL附加有50mg/L的利fu平的液體LB培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，過夜；
2) 取2mL培養(yǎng)物至50mL液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5左右；
3) 將培養(yǎng)物冰浴30min，4℃，5000rpm，離心5min，棄上清；
4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl懸浮菌體；
5) 4℃，5000rpm，離心5min，棄上清；
6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2懸浮，分裝成50uL/管，液氮速凍后，-80℃保存。
2. 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
1) 冰浴融化農(nóng)桿菌LBA4404/GV3101感受態(tài)細(xì)胞；
2) 加入3ul表達(dá)載體質(zhì)粒，冰浴30min，液氮中凍1 min，然后在37℃水浴5min；
3) 加入950uL無抗生素的YEP培養(yǎng)基，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)4h；
4) 1 0000rpm離心1 min以濃縮菌液，用100uL YEP回溶菌體；
5) 將回溶后的菌體涂于附加50mg/L卡na霉素和100mg/L利fu平的固體YEP培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36-48h。菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
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